ATCC菌株复苏算不算传代？种子批系统+5代传代法则破解实验室管理难题

多年来，ATCC（美国典型培养物保藏中心）提供的微生物标准品已被CLSI（美国临床和实验室标准研究所）和USP（美国药典）等国际权-威标准广泛纳入制药及医疗质量控制体系，广泛应用于产品质控、对照实验及菌种鉴定。然而，尽管使用规范已高度成熟，实验室在传代次数管理、非参考菌株传代阈值界定等实操环节仍存在显著挑战。这一问题在制药微生物领域专业论坛（如PMFList）中持续引发讨论，凸显了制定统一操作框架的迫切性。

一、参考菌株命名差异与来源要求

参考菌株的命名差异加剧了实验室对微生物标准品管理的困惑。在CLSI和USP的各类文件中，这类培养物被分别称为“对照菌株"“标准培养物"“参考菌株"“测试菌株"或“质量控制菌株"，其中“参考菌株"或“参考培养物"的称呼较为普遍。

尽管这些术语常被混用，但两个组织均强调，参考菌株必须来源于权-威机构，ATCC（美国典型培养物保藏中心）是主要的推荐来源，这为实验室选择参考菌株提供了明确方向。

二、ATCC参考菌株的传代培养体系

ATCC的参考菌株通过传代培养制成“储备培养物"，再通过每周或每月的定期传代培养制成日常使用的“工作培养物"，工作培养物通常以斜面形式保存。然而，这种传代培养方式引发了人们对其是否源自原始参考菌株的疑问。

（一）传代计数规则的演变

核心争议在于如何界定“一次传代"的计数规则。

早期USP36-NF31<51>抗菌测试的原始定义为：“一次传代指将生物体从已建立的培养基转移到新鲜培养基的过程，所有转移操作均计入传代次数"。但未明确"已建立的培养物"的具体内涵。

现行USP<1117>《微生物最佳实验室规范》对此进行了重要修订。更新后的定义为：“传代指微生物从活体培养物转移至新鲜培养基并实现增殖的过程，任何形式的传代培养均视为一次转种/传代。"这一修订有效解决了原定义的模糊性，根据新定义，ATCC冷冻或冻干菌株的解冻或水化操作不计入传代，只有将其接种至新鲜培养基并完成生长后才计为首-次传代。

因此，将ATCC冷冻或冻干小瓶中的参考菌株复苏制备成储备培养物属于首-次传代，而将储备培养物转种为工作培养物则构成第二次传代，后续每次转种均累计增加传代次数。通过统一术语和明确定义，为抗菌效果测试提供了清晰可追溯的传代计数标准。  

在微生物实验室实践中，除ATCC官-方提供的标准菌株外，商业机构常通过“ATCC衍生"方式获得培养物——即从ATCC参考菌株出发，经过一次或多次传代培养获得的菌株。

（二）“ATCC衍生"培养物的管理

在微生物实验室实践中，商业机构常通过"ATCC衍生"方式获得培养物，即从ATCC参考菌株经一次或多次传代培养所得。CLSI认可符合资质的商业菌株供应商，但要求实验室必须关注菌株传代历程，从原始ATCC参考菌株到最终工作培养物，通常会经历1-2次传代过程。

三、参考菌株管理的推荐系统与标准

（一）种子批系统的应用

USP推荐采用种子批系统管理参考菌株，该系统与ATCC使用的系统一致。操作流程为：先将ATCC参考菌株一次性制备多个重复传代培养物，这些源自同一代原种的重复培养物作为实验室的初代种子库存储；再将初代种子培养物传代至第二代，用于制备工作菌株的多批次培养物，以此规范实验室参考菌株的保存流程。（图1）

（二）传代次数控制标准

不同标准对传代次数的要求存在显著差异。CLSI早期标准对传代频次要求模糊，后续修订版提出三级传代限制，但推算后原始菌株累计传代可能达七次。而USP标准通过<1117>章节明确规定，实验室工作培养物与ATCC参考菌株的传代差值不得超过五次，<51>条款强调“检测用活体微生物不得超出原始ATCC菌株五代传代" ，这一量化标准被制药行业广泛采用，ATCC官-方也确认五代传代限制是维持菌株遗传稳定性的最佳实践。

（三）储存温度与维护要求

菌株的储存温度对其生物学特性及存活率具有显著影响，各标准机构对此给出了详细指引。

1、CLSI标准

（1）原代培养物：

短期保存：-50℃至-70℃保存1年。

长期保存：-70℃以下。

延长储存：-20℃或更低温度（优先推荐-70℃以下）

（2）工作培养物（斜面）：

短期保存：2-8℃环境，保存周期≤4周。

2、USP36-NF31<51>条款

（1）培养物：必须储存于液氮或-50℃以下的机械冷冻设备。

3、ATCC标准

（1）冷冻菌株：

长期保存：液氮气相环境或-80℃机械冷冻箱（避免直接浸入液氮）。

甘油保护剂：含50%甘油的菌株可短期保存于-20℃（≤1个月），需避免温度波动（如反复冻融）。

（2）冻干菌株：2-8℃保存。

（3）冻干菌株（斜面）：2-8℃保存≤1周。

4、特殊注意事项

质控菌株（如携带耐药基因质粒）：需严格遵循CLSI最新标准。