鲎试剂法遭遇LER挑战，药品安全信任链危矣？

近年来，随着生物制剂复杂性的增加，内毒素低回收率（Low Endotoxin Recovery,LER）现象对药品安全检测体系的挑战愈发凸显。FDA已强制要求制药企业在提交生物制品上市申请（BLA）时，必须提供研究数据证明鲎试剂法（USP<85>）在特定时间段内从加标样品中回收内毒素的能力。这一举措直指LER现象的核心矛盾——当标准化鲎试剂（LAL）检测因基质干扰无法准确回收内毒素时，如何确保药品的安全性未被系统性低估？

一、内毒素低回收率现象的发现与定义

内毒素低回收率是指在药品或制剂中，经标准化鲎试剂（LAL）检测时，内毒素控制标准品（CSE）的回收率显著低于预期的现象。该现象最早在含螯合缓冲液及聚山梨酸酯类辅料的单克隆抗体药物研究中被发现：当LAL试剂与特定基质接触后，其对CSE的反应性呈现温度依赖性、瞬时且可重复的下降。

需注意的是，“内毒素"与“CSE"存在本质区别：内毒素是革兰氏阴性菌外膜的天然混合物，以囊泡形式存在；而CSE是通过人工纯化的脂多糖（LPS），通常添加稳定剂和赋形剂以延长保质期。药典内毒素参考标准品（RSE）和市售CSE主要用于校准、建立标准曲线及药典适用性研究。

二、LER的潜在机制：多因素综合作用

尽管LER的确切机制尚未完-全明确，但研究提出了多因素综合作用的假说：

1、电荷屏蔽效应

LPS在pH＞2时带负电荷，可能与CSE和阳离子蛋白质结合，“掩盖"LPS的作用，降低其可检测性。

2、螯合剂影响

LAL试剂需要二价阳离子进行反应，螯合剂可能封存这些阳离子，降低试剂活性。然而，研究表明添加Mg2+对恢复LER中的活动作用有限。

3、表面活性剂诱导的构象改变

聚山梨醇脱氧胆酸钠（Doc）和十二烷基硫酸钠（SLS）等分散剂可使LPS胶束解离成更小的复合物或单体，降低其生物活性。有趣的是，这些胶束可能在去除洗涤剂后重新形成，恢复活性。

4、多因素综合作用

最终LER机制可能是螯合剂类型和浓度、聚山梨酯类型和浓度以及蛋白质离子性质等多种因素共同作用的结果。

三、LER与检测干扰的关联性

LER属于细菌内毒素检测（BET）中的抑制性干扰，需通过适用性测试排除。USP<85>要求将样品稀释至无干扰状态以定量回收CSE活性，但未强制要求未稀释产品的回收率达标。

实际研究表明，即使通过适用性测试，含LER基质的产品仍可能无法从原液中定量回收CSE。FDA研究进一步证实，LER现象广泛存在于含螯合剂或表面活性剂的制剂中，且在加速稳定性研究中，CSE加标后的回收率随时间推移呈现动态变化。

四、实验设计的四重防线

实验室可以制备内毒素，但没有标准方法，分析人员需保持方法清晰一致。

1、明确规定测试参数和验收标准：因为LAL试验的标准曲线Y-截距变异可能放大LER效应。

2、加标量需实测而非假设：例如标称5EU/mL但实际仅1EU时，简单计算可能导致错误结果。

3、时效性管理：LER效应具有时效性，动物试验与体外检测（如BET）需严格同步操作，避免因时间差导致结果偏差。

4、方法学选择：考虑不同检测方法（如LAL、配体、单核细胞活化试验）间的差异。实验室自制内毒素的标准化是另一难点。现行指南要求其活性需与RSE/CSE在动力学参数（起始时间、反应斜率等）上一致，但冻干制剂与溶液态内毒素的效价定义差异（EU/ng和EU/mL）增加了比对难度。

*活性与效价的区别：活性以浓度表示，通常为EU/mL，或在RSE的情况下为EU/瓶。购买的CSE以冻干制剂形式提供，按重量填充，通常为ng/vial。

效价定义为CSE的特定活性，即活性/单位重量，通常为EU/ng，效价测定是将重构CSE的重量单位（ng/mL）与重构RSE的活性单位（EU/mL）关联，得出以EU/ng为单位的CSE效力的方法。

五、LER对药品安全性评估的影响

尽管FDA数据显示，2004-2015年间仅5次生物制品召回涉及实际安全问题，且均与LER无关，但监管层仍强调需优先采用与RSE/CSE特性匹配的实验室自制内毒素进行方法验证。这一策略的逻辑在于：若LER源于CSE与天然内毒素的差异，则通过匹配二者理化特性的加标物，可最大限度模拟真实污染场景，从而避免假阴性风险。

六、结论

LER现象揭示了标准化内毒素（CSE）与天然内毒素在理化性质及基质相互作用上的本质差异，尽管其可能导致内毒素检测结果被低估，但现有证据表明并不直接威胁药品安全性，制药行业需在确保检测科学性的前提下，持续探索机制并优化标准，以平衡LER风险与检测效率，巩固鲎试剂法（LAL试验）作为内毒素质量控制核心检测工具的地位