鲎试剂检测法误差根源大起底，你的细菌内毒素检测结果真的靠谱吗？

鲎试剂测定法，作为药典如USP<85>章所规定的关键方法，广泛应用于细菌内毒素的检测。尽管其重要性不言而喻，但该方法的测量结果易受多种分析条件变化的影响，导致LAL（鲎试剂）测定的结果具有较高的可变性。这种可变性主要源自试剂质量、待测产品特性以及检测方法本身，尤其是在采用光度测定方法（包括显色法和浊度法）时更为显著。因此，本文深入探讨了LAL测试变异性的原因，并着重阐述了通过实施有效的实验室质量控制措施来评估和减少这种变化的重要性。

一、鲎试剂测试变异性的来源

（一）鲎试剂

鲎试剂作为一种源自生物的复杂混合物，包含了多种酶和辅助因子，因其非单一纯化酶的特性，使得每批裂解物的酶活性难以精确测量。此外，生产过程中引入的缓冲剂和表面活性剂进一步加剧了批次间的差异。为了评估每批鲎试剂的酶活性，制造商通常依赖美国药典的内毒素参考标准品（RSE），但鉴于RSE的稀缺性和高昂成本，多数实验室转而使用由鲎试剂供应商根据RSE评估确定的效力的细菌内毒素工作标准品（CSE），这一做法无形中增加了测试结果的变异性。

（二）细菌内毒素

实验室制备的细菌内毒素工作标准品（CSE）源自高度纯化的大肠杆菌菌株，主要成分为脂多糖并添加了稳定填充剂，而环境内毒素则通常以未纯化的形式存在，为大分子复合物，这导致了在利用CSE进行测定时两者间存在差异。此外，尽管鲎试剂对细菌内毒素具有高度特异性，但它仅能检测细菌内毒素分子中负责激活裂解物的脂质A部分。值得注意的是，脂质A部分可能形成未充分分散的聚集体，造成检测不均匀，从而导致样品中的细菌内毒素含量被低估。此外，细菌内毒素分子的化学特性和稳定性随时间推移而发生变化，这进一步影响了检测结果的准确性。

（三）鲎试剂检测法本身的变异性

LAL检测法的变异性较高，范围在50%至200%之间。这种变异性主要源于细菌内毒素标准曲线的斜率以及多种测试输入因素的变化，如试管、移液器吸头、无菌技术、分析技术、移液方法差异、控制标准品制备差异、稀释液配制变化等。此外，长期储存稀释液的变化、交叉污染、产品或样品干扰、取样容器、样品储存时间和温度、LAL仪器/模块变化等也会影响检测结果，其中部分问题与检测技术人员操作直接相关。

（四）内毒素浓度

标准系列使用的细菌内毒素浓度越小，误差显著性越大。例如，1.0至0.1EU/mL的标准曲线与5.0至0.005EU/mL的标准系列相比，前者在50%至200%的误差影响范围内更为稳定。这也是药典中测试对照品可接受加标回收率为50%至200%的原因之一。

（五）稀释误差

测试稀释尤其是稀释细菌内毒素和绘制标准曲线时可能出错。为避免误差，建议每批细菌内毒素或裂解物常规使用前应由3名技术人员对稀释系列鉴定并验证3次。

常规检测时，不同试验稀释顺序应一致，且细菌内毒素起始浓度应始终保持相同（通常为1000EU/mL），因为细菌内毒素标准曲线是基于相同的细菌内毒素起始浓度（1000EU/mL）绘制的，这一点可通过查看生产商分析证书或或对比细菌内毒素工作标准品（CSE）与美国药典内毒素参考标准品（RSE）来验证。

（六）标准曲线

线性关系标准曲线的一致性是鲎试剂检测的一个重要特征。线性标准曲线的y轴截距仅发生1%的变化，就会导致细菌内毒素测定值发生30%至35%的变化。因此，控制浊度法LAL检测的变异性时，需要密切关注起始（反应）时间。

二、评估差异的方法

尽管可以采取措施来降低变异，但遵循良好质量控制的原则，实验室仍需具备监督和评估的手段，以确保检测结果的满意度，并判断变异是否达到了值得关注的程度。其中一种有效的监督方法就是审查变异系数（CV）。

（一）变异系数（CV）的应用

变异系数是衡量精确度的一个重要指标，以平均值的百分比表示标准差。在鲎试剂检测中，CV通常表示为测试重复之间的百分比（%CV），可应用于标准曲线点和测试样品复制。根据裂解物供应商设定的要求，常见的精确度要求是CV不超过10%或25%。%CV值越低，意味着不同测试副本之间的精确度越高，结果越接近。值得注意的是，随着细菌内毒素浓度的降低，%CV值通常会上升。此外，不同的鲎试剂供应商在鲎试剂检测的验收标准和计算%CV值的方法上存在差异。

（二）检测稀释错误

除了变异系数，稀释误差也是评估鲎试剂检测准确性的重要方面。为了确保检测的准确性，需要检查标准曲线上细菌内毒素最高浓度的起始反应时间，确保其处于预期的秒数范围内，因为即使是微小的起始时间变化也可能显著影响线性度、斜率和Y-截距，从而对测试结果产生重大影响。

通过对历史数据进行研究，特别是对前-100次使用细菌内毒素的测试进行评估，可以确定起始细菌内毒素浓度（如5.0EU/ml）的典型起始时间范围。起始时间是检测误差的关键指标，因为它直接关系到光度法LAL检测方法的原理，即裂解液与样品或标准曲线稀释液中的细菌内毒素反应的时间越快，细菌内毒素浓度越高。

根据平均值的第二个标准偏差，可以计算出起始浓度的光密度达到所需阈值所需的时间范围。鉴于LAL检验本身存在误差（通常认为误差为±25%），为了与其他生物检验方法保持一定程度的标准化，第二个标准差可以说是最合适的测量方法。标准差是衡量单个元素偏离平均值（均值）的程度。其计算公式为方差的平方根（如图1所示）。

在LAL检测中，使用平均值的两个标准差来界定起始时间的正常范围，能确保95%的测试值落在该范围内，超出此范围的5%则被视为非典型值。每次检测后，需将最高细菌内毒素浓度点的起始时间与这一范围进行对比，以验证检测的合格性。

（三）标准曲线相关系数

每次测试都应检查标准曲线的相关系数（要求相关系数大于或等于0.980），这是药典要求。标准曲线的一致性很重要，线性标准曲线Y-截距的微小变化会导致细菌内毒素测定结果大幅变化。

（四）阴性对照

每次检测都要进行阴性对照，阴性对照是构建标准曲线的水样，可显示制备细菌内毒素系列时是否污染，其细菌内毒素含量必须低于标准曲线中的最-低细菌内毒素浓度（常规标准系列为0.05EU/mL），这也是药典要求。

影响LAL检测的变异性和测试误差来源众多，技术人员在设计检测方法和调查检测异常时，了解这些因素至关重要。变异系数是衡量变异性的关键指标，技术人员审查测试结果时需重点检查，同时结合检测稀释错误、标准曲线相关系数和阴性对照等方面的评估，做好实验室质量控制，以确保LAL检测结果的可靠性。